正常ヒト由来線維芽細胞の石灰化に対する海洋深層水の抑制機序
- 標題
- 正常ヒト由来線維芽細胞の石灰化に対する海洋深層水の抑制機序
- 作者
- ○山田勝久・柴田雄次・山本樹・野村道康1)、今田千秋2) （1）㈱ディーエイチシー、2) 東京海洋大学）
- 文件屬性
- 日本研究
- 知識分類
- 基礎研究
- 點閱數
- 2743
摘要
１．目的
海洋深層水（以後，DSW）のヒトの皮膚科学的有用性に関する研究報告は未だ数少ない．前回我々は正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（以後，NB1 細胞）を用いた研究で，UVA 照射が石灰化を誘導することに加えて，DSW がこの現象を軽減することを報告した1)．そこで今回は，UVA が照射されたことにより細胞に生じる活性酸素分子種（以後，ROS）の動態2)および石灰化の主要因子である細胞におけるCa 変動について観察すると共に，DSW 添加によるこれら因子の変化について調べることを目的とし
た．
２．方法
DSW および表面海水（以後，SSW）は伊豆赤沢で同日（日付を入れる）に取水したものを用いた．また全ての評価系において，NB1 細胞は96 穴マイクロプレートに2 万個／穴となるように播種した後，2 日間前培養を行った．前培養後，培地をPBS(-)（日水製薬）に置換してUVA（FL15BLB，東芝）を照射（0.8 J/cm2）したのち，Ca/Mg=2 に調整した10%FBS 含有イーグルMEM 培地（日水製薬）培地（2 倍希釈品）を用いて1 晩培養した．培養後，細胞を冷メタノールで固定したのち，ROS 発生による酸化ストレスマーカーである蛋白質のカルボニル化およびCa の蓄積を各々の選択的蛍光
プローブ（カルボニル化蛋白質，FTCZ; Ca,Fura-2）を用いて調査した．次にDSWの石灰化抑制機序を調査するために，UVA 照射後にDSW を添加して1 晩培養した細胞について，ROS およびCa の変化をSSWと比較した．またDSW，SSW にかかわらず海水中に豊富に存在するMg がCa 蓄積に影響を
及ぼす可能性が推察されたので，Mg の蓄積変動を調べるために，Mg 選択的プローブ（KMG-20）を用いて観察した．なお，細胞の観察には蛍光顕微鏡（オリンパス）を用いた．
３．結果および考察
NB1 細胞に対するUVA 照射は，ROS の発生を示唆するカルボニル化蛋白の生成を促した．また併せて，石灰化現象の本質成分であるCaの蓄積が誘導されることがわかった．UVA 照射後にDSW を含む培地で培養すると，DSWの添加濃度に依存してNB1 細胞へのCaの蓄積が抑制された．その効果は，比較対照として設定したSSW に比べて強かった．これは前回の本大会で報告したアリザリンレッド-S を用いた石灰化抑制効果の判定結果と一致した．次にDSWが有する石灰化抑制作用機序を調査したところ，UVA 照射後のカルボニル化蛋白の生成状態から考えて，DSW はUVA 照射に伴うROS に対して制御できないことがわかった．またDSW 中に豊富に存在するMg の影響について検討した結果，UVA 照射後のNB1 細胞に対するDSW のCa 蓄積抑制作用とMg の間には相関が見られなかった．これらのことからDSW は，UVA 照射後のNB1 細胞に対してCa およびMg の細胞への蓄積を共に抑制する作用が示唆された．今後はDSW の石灰化抑制機序解明に向けて，分子生物学的なアプローチを計画している．
海洋深層水（以後，DSW）のヒトの皮膚科学的有用性に関する研究報告は未だ数少ない．前回我々は正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（以後，NB1 細胞）を用いた研究で，UVA 照射が石灰化を誘導することに加えて，DSW がこの現象を軽減することを報告した1)．そこで今回は，UVA が照射されたことにより細胞に生じる活性酸素分子種（以後，ROS）の動態2)および石灰化の主要因子である細胞におけるCa 変動について観察すると共に，DSW 添加によるこれら因子の変化について調べることを目的とし
た．
２．方法
DSW および表面海水（以後，SSW）は伊豆赤沢で同日（日付を入れる）に取水したものを用いた．また全ての評価系において，NB1 細胞は96 穴マイクロプレートに2 万個／穴となるように播種した後，2 日間前培養を行った．前培養後，培地をPBS(-)（日水製薬）に置換してUVA（FL15BLB，東芝）を照射（0.8 J/cm2）したのち，Ca/Mg=2 に調整した10%FBS 含有イーグルMEM 培地（日水製薬）培地（2 倍希釈品）を用いて1 晩培養した．培養後，細胞を冷メタノールで固定したのち，ROS 発生による酸化ストレスマーカーである蛋白質のカルボニル化およびCa の蓄積を各々の選択的蛍光
プローブ（カルボニル化蛋白質，FTCZ; Ca,Fura-2）を用いて調査した．次にDSWの石灰化抑制機序を調査するために，UVA 照射後にDSW を添加して1 晩培養した細胞について，ROS およびCa の変化をSSWと比較した．またDSW，SSW にかかわらず海水中に豊富に存在するMg がCa 蓄積に影響を
及ぼす可能性が推察されたので，Mg の蓄積変動を調べるために，Mg 選択的プローブ（KMG-20）を用いて観察した．なお，細胞の観察には蛍光顕微鏡（オリンパス）を用いた．
３．結果および考察
NB1 細胞に対するUVA 照射は，ROS の発生を示唆するカルボニル化蛋白の生成を促した．また併せて，石灰化現象の本質成分であるCaの蓄積が誘導されることがわかった．UVA 照射後にDSW を含む培地で培養すると，DSWの添加濃度に依存してNB1 細胞へのCaの蓄積が抑制された．その効果は，比較対照として設定したSSW に比べて強かった．これは前回の本大会で報告したアリザリンレッド-S を用いた石灰化抑制効果の判定結果と一致した．次にDSWが有する石灰化抑制作用機序を調査したところ，UVA 照射後のカルボニル化蛋白の生成状態から考えて，DSW はUVA 照射に伴うROS に対して制御できないことがわかった．またDSW 中に豊富に存在するMg の影響について検討した結果，UVA 照射後のNB1 細胞に対するDSW のCa 蓄積抑制作用とMg の間には相関が見られなかった．これらのことからDSW は，UVA 照射後のNB1 細胞に対してCa およびMg の細胞への蓄積を共に抑制する作用が示唆された．今後はDSW の石灰化抑制機序解明に向けて，分子生物学的なアプローチを計画している．