東部深層海水創新研發中心

1．目 的
海洋深層水（以後，DSW）のヒトの健康分野への利用にあたり，そこに含まれるミネラル類の特徴（Ca/Mg 含有比が陸水と逆転していることやヒトの血漿中の組成に近似していること）については，非常に興味が持たれるところである．しかし，その摂取意義に関する研究報告が少ないのが現状である．そこで我々は，昨年の本大会で正常ヒト皮膚由来培養線維芽細胞（以後，NB1 細胞）を用いてCa/Mg 比の増加が細胞の活性を顕著に低下させること，さらにDSWはこの現象を軽減することを報告した1）．またKarppanen らの報告2）で周知となったCa/Mg 摂取比と虚血性心疾患発症リスクの相関の背景には，老化に伴う動脈硬化（メンケベルグ型動脈硬化）が潜んでいることが今日ではわかって
いる．一般に動脈硬化は血管の石灰化を伴っており，その発症機序に関しては既に血管由来の培養細胞を用いた多くの研究がなされ，現在では老化した細胞が石灰化に至るメカニズムについて詳細に解明されている3）．一方，血管由来細胞と同様に老化する皮膚細胞における石灰化の知見は見当たらない．そこで今回はCa/Mg 比の増加およびDSW の添加が，NB1 細胞の石灰化に与える影響ついて調査することを目的とした．
2．方 法
各継代数のNB1 細胞を96 穴マイクロプレートに2×104 個／穴となるように播種して 2 日間前培養を行った．前培養後，培地を交換し，CaCl2（試薬特級）でCa 濃度が2 mM になるように調製した後，MgCl2･6H2O（試薬特級）でCa/Mg 添加比が0， 1 および2 となるように培地を調製した後，各濃度のDSW を添加して1日間培養した．次にDSW 中の主要なミネラル成分であるMg に着目し，石灰化抑制効果が認められたDSW 濃度中のMg 量と同濃度に相当するMgCl2・6H2O を用いて効果を比較した．なお細胞の石灰化度は，アリザレンレッドS のカルシウム特異的結合反応に基づく市販のキット（Calcified nodule stein kit，コスモバイオ）を用いて染色した後，各穴に3%(v/v)酢酸含有50%(v/v)エタノールを100μl ずつ添加して色素を抽出し，マイクロプレートリーダー（OD450，Bio Rad）を用いて測定した．
3．結果および考察
NB1 細胞において，老化（継代数の増加）が石灰化に深く関係することが示唆された．また細胞の継代数にかかわらず，Ca/Mg 比の増加は石灰化を誘導した．さらに石灰化が誘導されるCa/Mg = 2 の条件下でDSW を添加した結果，添加濃度依存的に石灰化が抑制された．DSW の石灰化抑制効果の本質を究明するにあたり，我々はDSW 中の主要なミネラルであるMg に着目した．DSW 添加で有意な石灰化抑制効果が認められた1% (v/v) DSW 中のMg 濃度に相当する2mMMg を細胞に供した結果，Mg にも顕著な石灰化抑制効果が確認されたが，DSW の効果には及ばなかった．このことからDSW 中にはMg 以外にも石灰化抑制成分が存在することが推察された．